Вопрос о механизмах биологического действия озона на развитие зародышей птиц в настоящее время окончательно не выяснен. Накопленный экспериментальный материал недостаточен, чтобы делать окончательные выводы о механизмах действия озона, а потому и проблема биологического действия озона на организм является актуальной, разрешение которой будет иметь теоретическое и практическое значение.
Окружающая нас газовая среда - атмосфера всегда в некоторой степени озонирована, поэтому мы вправе принять озон за естественный фактор среды обитания живых организмов. Уже небольшие колебания в сторону повышения привычных для организма концентрации озона в воздухе вызывают заметные изменения биотонуса организма. Перемены погоды, колебания в напряженности поля атмосферного электричества, изменение активности космической и солнечной радиации, связанные с концентрацией озона в воздухе, отражаются на жизненных процессах.
Зародыш птицы, развиваясь в естественных условиях под наседкой, имеет иные параметры электрорежима воздуха, чем в условиях искусственной инкубации в инкубаторах. Это, в частности, было подтверждено экспериментальными данными сотрудников ВНИТИП Б. М. Хаметова и Г. К. Отрыганьева, которые установили, что под наседкой степень ионизации воздуха в десятки раз выше, чем в инкубаторе.
Известно, что там, где сильнее ионизирован воздух, выше и уровень озона. Причем ион озона (Оз) относится к первичным ионам, которые главным образом и определяют величину энергоемкости воздуха, характеризующую его активность (свежесть). Ионы других газов воздуха и различных частиц, образующиеся в последующем, являются вторичными и в меньшей степени влияют на энергоемкость воздуха.
Следует также выделить исключительную способность озона образовывать легкие отрицательные ионы за счет уменьшения тяжелых отрицательных монов в процессе перезарядки: 03+М - -M+05.
Эффективность этого процесса обусловливается высоким значением электронного сродства молекулы озона, оцениваемой величиной в 2,5 зВ.
Образование озона под наседкой происходит, по-видимому, под действием статического электричества на оперении птицы и приводит к повышению энергоемкости воздуха и снижению до нового уровня тяжелых аэроионов, чем частично и объясняется лучшее развитие зародыша в естественных условиях под наседкой, чем в инкубаторе.
Но можно ли одним этим объяснить те изменения в развитии зародыша, которые наблюдаются при добавлении озона в инкубатор? По всей вероятности, нельзя, потому что и при высоких концентрациях озона (по сравнению с естественным фоном) проявляется его влияние на зародыш. Компенсацией недостающего уровня содержания озона в воздухе в процессе инкубации яиц нельзя также объяснить его действие на зародыш при прединкубационной обработке яиц. Каковы же тогда пути биологического действия озона на зародыш птицы и какие его органы и системы этот фактор воспринимают?
В экспериментальных условиях было обнаружено, что озон проникает через скорлупу внутрь яйца и вступает во взаимодействие с его содержимым. В этой связи нам представляется, что озон) вероятно, действует на растворимую фазу белка (вода + ионы) и непосредственно на молекулу белка.
Озон по своей химической природе весьма активен и способен вступать в реакцию со всеми, как органическими, так и неорганическими (простыми и сложными) веществами. Результатом реакций озона с простыми веществами являются, как правило, продукты их окисления. Что же касается реакций озона со сложными веществами, то здесь проявляются его не только окислительные, но и восстановительные свойства. Поэтому во многих случаях в реакциях озона со сложными веществами образуются совершенно новые соединения, которым дано название озониды. Все озониды, как правило, являются нестойкими, быстро распадаются с выделением энергии и атомарного кислорода.
При распаде озонидов щелочных металлов образуются их гидроокиси, вода и атомарный кислород (48% по массе). При этом распад озонидов идет через промежуточное образование гидроокисла (ОН), который как свободный радикал сам активен. Не исключено, что именно образование гидроокисей в процессе распада озонидов приводит к повышению щелочности белка, а образование воды в процессе распада озонидов, по-видимому, приводит к снижению коэффициента рефракции белка. Но имеется и другое предположение в отношении разжижения белка при действии на него озона. Известно, что озон вызывает эффект флокуляции, т. е. оказывает. действие на коллоиды, разрушает их и дезорганизирует макромолекулярные органические ассоциации, от которых зависит в целом консистенция среды. В специальных исследованиях при действии озона на белок in vitro наблюдается снижение (до 10%) его коэффициента ре-фракции.
Еще в 1934 г. было определено, что нативные белки (яичный альбумин) плохо перевариваются протеолитическими ферментами. При частичной денатурации белков скорость их переваривания ферментами увеличивается в несколько раз. Усвояемость белка для зародыша в процессе его развития, по-видимому, улучшается при обработке яиц озоном, поскольку он способен денатурировать белки. Изменение конформации яичного белка под влиянием озона может быть обусловлено гидролизом его до свободных аминокислот. При этом в процессе действия озона на белок яйца его отдельные аминокислоты также могут подвергаться изменениям.
Установлено также, что действие озона на белки в более щелочной среде усиливается. Не исключено, что перестройки в аминокислотном составе яичного белка при воздействии озона приводят к изменениям его физико-химических свойств.
Н. П. Дубинин еще в 1963 г. высказал предположение, что образовавшийся атомарный кислород в процессе диссоциации молекул кислорода и озона вызывает образование свободных гидроксильных радикалов, которые могут вступать в прямую реакцию с нуклеиновыми кислотами. Гидроксильные радикалы во вторичных реакциях приводят к образованию гидропероксидных радикалов (НО,), которые еще в большей степени способны взаимодействовать с нукленновыми кислотами. Образование свободных радикалов обнаружено экспериментально при взаимодействии озона с водой. Взаимодействие озонидов с водой также приводит к образованию свободных радикалов. Вероятно, промежуточное образование свободных радикалов может иметь место и при взаимодействии озона с белком яйца и этим могут быть обусловлены наблюдаемые нами физико-химические изменения белка. Прямых экспериментальных доказательств о влиянии свободных радикалов, образующихся при акти-вации (озонировании) кислорода, на нуклеиновые кислоты пока нет. Но вопрос этот очень важен. С ним, возможно, связано изменение наследственности организмов и поэтому дальнейшие исследования в этом направлении могут быть очень полезными.
Замеченное последействие озона на процессы эмбрионального развития предварительно обработанных яиц, выразившееся в более интенсивном росте зародыша и в возрастании вывода цыплят, видимо, вызвано изменениями в состоянии белка. Эти изменения могли быть не только в Физико-химическом состоянии и аминокислот-ном составе, но и в ферментной и витаминной системах белка, обусловливающих их деятельность при усвоении питательных веществ зародышем. Известно, ЧТо при действии озона на белок in vitro активность лизо-цима ингибируется (до 30%) без нарушения его струк-туры, потому как спустя 12- 24 ч после снятия действия озона активность его снова восстанавливается до исходного уровня. В исследованиях при воздействии озона в концентрации 180 мг/м3 в течение 15 мин на яичный белок (разведение 1:1200) было обнаружено снижение активности лизоцима до 40 - 70% с 1,32 до 0,89 мг/мл и с 0,96 до 0,54 мг/мл. Ингибирование активности лизоцима, по-видимому, снижает его ферментативное действие на углеводы белка, а это, возможно, приводит к лучшей длительной сохранности яиц.
Большую роль в обмене веществ при развитии зародыша играют витамины яйца. Но некоторые витамины, содержащиеся преимущественно в белке, часто становятся труднодоступными для усвоения зародышем. В частности, использование им биотина белка зависит от количества и активности авидина и прочности связи его с биотином. Авидин в свежем белке связывает биотин в комплексе (авидин-биотин), нерастворимый в воде, который не может быть использован организмом, в результате чего биотин теряется. Если же авидин денатурируется (например, нагреванием до 100° С), то связывание био-тина не происходит, и он остается активным. Установлено также, что при взаимодействии белка с озоном происходит изменение спектра поглощения окисленных триптофановых остатков утрачивается особенность авидина к связи с биотином. В этой связи можно допустить, что при обработке яиц озоном в белке происходит ингибирование активности авидина к связыванию с биотином в нерастворимый комплекс (авидин - биотин), и это может существенным образом отразиться на после-дующей активности биотина в процессе эмбрионального развития. Биотин также участвует в реакциях фиксации СО, при карбоксилировании пировиноградной кислоты с превращением ее в щавелевоуксусную, играющую большую роль в 'обмене веществ. Прямое воздействие озона на зародыш в период предынкубационной обработки яиц вряд ли могло быть, так как маловероятно, что он достигает его тканей. По-видимому, в результате физико-химических и морфологических изменений в белке яйца под действием озона появляются новые высоко-активные продукты белкового распада или окисленные продукты, которые не являются индифферентными для зародыша. Эти вещества по мере накопления, вероятно, в первую очередь вызывают раздражение нервных окончаний в кровеносной системе и в тканях органов развивающегося зародыша. Раздражение нервных окон-чаний, в свою очередь, влечет к возникновению сложных рефлекторных явлений, приводящих к изменению обмена веществ, и т.п.
Таким образом, можно предполагать, что действие озона на последующее развитие зародыша при предынкубационной обработке яиц сводится к нервно-рефлекторному пути, а изменения в развитии и деятельности отдельных органов (сердце, печень, легкие, желудок). И систем зародыша (кровообращение и газообмен) следует считать вторичными проявлениями ответной реакции.
Основным источником энергии для всех биологических проявлений зародыша в его развитии являются реакции окисления с участием кислорода воздуха. Дыхание - основной процесс, снабжающий живой организм энергией.
Зародыш на всех стадиях своего развития потребляет атмосферный кислород. На самых ранних стадиях его дыхание осуществляется как у представителей низших форм животных: путем простой диффузии газов, растворенных в воде.
Дыхательный обмен в начале эмбрионального развития (первые сутки) у зародыша осуществляется благодаря запасам кислорода, растворенного в содержимом яйца (в основном в желтке). Разумеется, что от количества растворенного кислорода в содержимом яиц зависит и степень дыхательного обмена зародышей в первые сутки развития. Не исключено, что растворенного кислорода в содержимом яиц не всегда хватает для удовлетворения потребности зародыша. В ряде случаев «кислородизация» яиц перед инкубацией путем 30-минутного выдерживания их в 100%-ном кислороде повышает жизнеспособность зародышей и вывод цыплят. Поэтому можно предположить, что и выдерживание яиц перед инкубацией в атмосфере озона будет способствовать накоплению кислорода в их содержимом. Это обусловливается высокой агрессивной способностью озона взаимодействовать с различными веществами, в силу чего высвобождается много кислорода. Озон обладает также более высокой по сравнению с кислородом (в 15 раз) растворимостью в воде. Уже в первые 48 ч развития зародышей в яйцах, находившихся в атмосфере озона, зародышевое дробление и дифференцировка протекают более интенсивно, чем в яйцах контрольных групп.
Дыхательный обмен зародышей имеет весьма сложный характер, что обусловлено периодической сменой ме-ханизмов дыхания. Атмосферный кислород поступает в яйцо через поры скорлупы и за счет диффузии через двухслойную подскорлупную оболочку. Проницаемость скорлупы для газов неоднородна: тупой конец на 25% более проницаем, чем острый. Различные газы проникают через скорлупу с разной скоростью. Быстрее всего проникает водород, затем углекислота и медленнее всего кислород.
Можно предположить, что при развитии зародышей поступление кислорода в яйца не всегда бывает достаточным, в силу чего потребность в нем полностью не удовлетворяется. Активный кислород (атомарный и озон), по-видимому, обладает большей способностью проникать через скорлупу яиц, чем обычный кислород. Это может быть обусловлено тем, что молекула озона имеет несимметричную и подвижную структуру, и поэтому способность такой молекулы к прохождению через различные капилляры, а также мембраны более высокая.
Имеются также сведения, что озон способен изменять градиент альвеолярно-капилля «Пого давления и тем самым увеличивать проницаемость структур, находящихся между воздухом и кровью. Поэтому причину усиления газообмена зародышей, наблюдавшуюся при воздействии озона, вероятно, следует искать в увеличении притока кислорода и поступлении его в кровяное русло. Прямое поступление озона в кровь вряд ли могло быть, так как при прохождении через клеточные мембраны кровеносных сосудов он должен рекомбинировать, т. е. превратиться в кислород как активной (атомарной), так и моле-кулярной форм. Но при распаде двух молекул озона образуются три молекулы кислорода (20;-->302), что приводит к повышению парциального давления кисло-рода. Повышение парциального давления в крови уси-ливает эритропоэз и гемопоэз. Это подтверждается опытами по инкубированию яиц при различном парци-альном давлении кислорода в воздухе. Установлено, что низкие концентрации кислорода в воздухе (не более 17%) и высокие (75- 100%) снижают жизнеспособность зародышей.
Но незначительные добавки кислорода положительно влияют на эмбриональное развитие. При этом особенно хорошие результаты были получены при уровне кислорода в воздухе, равном 32%.
Дополнительное введение кислорода непосредственно в яйца (5-10 мл в воздушную камеру) также повышало вывод цыплят до 10%.
Проникновение озона из воздуха в яйца происходит по градиенту концентраций от высокой к низкой до установления равновесия. Если рассматривать этот процесс для идеальных газов (кислород, азот и др.), то это равновесие устанавливается тогда, когда концентрации внутри и вне яйца становятся равными. Но совсем другая картина имеет место при диффузии озона внутрь яиц. Проникнув в яйцо, озон, взаимодействуя с его содержимым, распадается, превращаясь в кислород, тогда как вне его озон образуется постоянно. Создается как бы своеобразный насос для доставки кислорода.
Таким образом, имеются основания предполагать, что озонирование воздуха при инкубации приводит к ак-тивации и усилению поступления кислорода внутрь яиц и увеличению содержания кислорода в крови зародыша.
Зародыш в процессе развития проявляет различную чувствительность на внешние воздействия, а следователь-но, и функциональная нагрузка на отдельные его органы и системы будет иметь определенные пределы. Это обусловлено прежде всего сменой способов и источников дыхания и питания зародыша, а также сопротивляемостью организма. Неслучайно поэтому, что в отдельные периоды развития зародыш становится более чувствительным к воздействию внешних агёнтов. В исследованиях на эмбрионах птиц было отмечено, что озонирование в течение первой недели инкубации приводит к угнетению развития. По-видимому, в этот период дополнительная функциональная нагрузка, вызванная воздействием .озона, являясь избыточной, тормозит развитие заро-дыша. В другие же периоды, например, в течение второй и третьей недели инкубации, наоборот, дополнительная функциональная нагрузка от воздействия озона усиливает развитие зародыша.
Интересно отметить, что при постоянном озонировании в течение всего периода инкубации, развитие зародыша значительно усиливается. Почему же тогда при воздействии лишь в течение первой недели инкубации наблюдается угнетение в развитии зародыша? Нам представ-ляется, что угнетение развития зародыша при кратковременном воздействии озона в течение первых семи дней обусловлено не только критическим периодом эмбрио-нального развития, но и перестройкой, которую претерпевает организм после снятия стресс-фактора, каковым в дан-ном случае является озон. Это находит подтверждение в учении Г. Селье об адаптационном синдроме при различных стрессовых состояниях организма. Воздействие озона в начале инкубационного периода (в течение первой недели) снижало выводимость яиц на 2,6%. Но при воздействии озона в течение двух последних недель инку-бацин и постоянно с 1-го по 19-й день повысился вывод цыплят от 3,9 до 6,0%.
При изучении содержания воды в белке, желтке и в теле зародыша были замечены значительные различия для желтка и зародыша, которые связаны с периодом обработки озоном. При исследовании содержания липи-дов в желтке и в теле зародышей при воздействии озона в различные периоды инкубации также были обнаружены заметные сдвиги в структуре жирных кислот. Более значительные изменения отмечены по пальмитиновой кислоте (в желтке яиц почти во всех группах при воздействии озона в различные периоды инкубации содержание ее увеличивалось или уменьшалось соответственно содержанию этой кислоты в жире тела зародыша).
Есть основание считать, что это обусловлено усилением обмена веществ в яйцах, обработанных озоном. Все остальные жирные кислоты, входящие в липиды желтка и тела зародыша, и в частности оленовая, пальмитиновая и линоленовая, претерпевают изменения, которые связаны со временем обработки и концентрацией озона.